13505162673
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蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
蛭弧菌、噬菌体混合培养物的研究背景
秦生巨
目前国内外用于细菌病的防治药品，主要有抗生素和化学合成抗菌药物。此类药物的使用，一是不断产生抗药菌株，有效用药量逐渐增大，引起对所有抗菌药物都不敏感的“超级细菌”的产生；二是在体内残留，抑制机体正常生长代谢，殃及人体健康；三是污染环境，同样会危害人体健康。因此，研制开发高效无毒的生物防治细菌病的方法和制品引起了人们极大的兴趣和关注，各类生物生态制剂的研究正在崛起，以菌制菌的生物防治方法倍受重视。
60年代发现的蛭弧菌是一类专门以捕食细菌为生的寄生性细菌，具有“寄生”和“溶解(杀灭)”有害细菌的独特的生物学特性，它通常比一般细菌小。蛭弧菌的作用可有选择的吸附到宿主菌细胞上并进入宿主菌细胞内，在其中生长繁殖，最终导致宿主菌细胞裂解。它对许多人体、动物、植物致病菌和环境中的有害细菌都有寄生和裂解的作用,这一独特的生物学特性引起了研究者的高度重视。但长期以来，国内外研究者一直认为蛭弧菌的生长温度为20-30℃，最适生长温度为26.3℃,35℃以上就不能生长繁殖，且只能在活菌上生长。而人体内的正常温度一般为37℃左右，动物体内的正常温度一般为40℃左右。除蛭弧菌对温度特别敏感外，环境中培养的蛭弧菌在体内易失活；又在活菌上培养蛭弧菌的生产过程中，活菌易污染环境，且培养周期长，收获量低，培养物中活菌的残留对环境有害；尤为突出的是，蛭弧菌对宿主裂解范围广、敏感性强，但特异性不及噬菌体。
噬菌体是20世纪初发现的一类能溶解（杀灭）细菌的细菌病毒。噬菌体对宿主菌细胞有高度的特异性，噬菌体的宿主范围是鉴别菌株的一个有用的特性。噬菌体用于某些细菌病的治疗具有独特的效果，尤其是对耐药菌株引起的疾病。噬菌体是以尾鞘吸附到宿主菌细胞特定的受体位点上，收缩头部通过尾针向宿主菌细胞体内注射DNA，并在宿主菌细胞体内复制子代，最终类似蛭弧菌溶解宿主菌细胞的方式，释放子代。噬菌体不能在停止新陈代谢的宿主菌细胞内生长繁殖。噬菌体对宿主菌的敏感性不及蛭弧菌,但噬菌体对相应的宿主菌高度特异。
因此人们利用蛭弧菌防治人体、动物、植物细菌病，果、蔬、花卉、食品、水产品保质保鲜和清除环境中有害细菌、抑制蓝藻生长的开发和应用受到了极大的限制。
蛭弧菌培养物和噬菌体培养物联合使用，使得蛭弧菌的敏感性和噬菌体的高度特异性优势互补，有显著的协同作用。完全可以消除使用抗生素和化学合成药物产生抗药性、体内残留、抑制正常生长代谢、污染环境的弊端。
建议研究内容：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的生物防治
现有的研究基础
一：蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；不同种属的细菌菌株由中国药品生物制品检定所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对24株不同种属细菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334和弧菌噬菌体∮V3、∮M6、∮1a、∮1b，志贺氏菌噬菌体∮P22、∮119X、∮17、∮／F２ａ，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5、∮A、∮B。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：
蛭弧菌培养物的制备：参见中华微生物学和免疫学杂志1982 ，2（1）：12-15。获得的蛭弧菌和失活的大肠杆菌宿主加入自来水半固体上层琼脂中混合，然后倾倒在自来水双层琼脂平板上，使其凝固，接着３７℃培养２８小时，选取噬斑典型的蛭弧菌，挑取单噬斑浸泡于灭菌自来水中，然后，取上清再制双层琼脂平板，调高温度培养，并反复数次，直至选育出在10-43℃环境中能生长的蛭弧菌株Ｂｄ39、Ｂｄ40、Ｂｄ59、Ｂｄ76、Ｂｄ81、Ｂｄ94、Ｂｄ98、Ｂｄ329、Ｂｄ334。
然后，以失活的大肠杆菌为宿主，校正其pH值至3.8-10.0，经发酵培养，即得到蛭弧菌培养物。
噬菌体培养物的制备：参见 Bacteriophages Interscience Publishers,Inc.,New York USA.或《噬菌体》1975年，司穉东、陈廷祚主译。江苏噬菌体研究室编印。以相应的弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌培养物为宿主，筛选对相应弧菌，志贺氏菌，伤寒杆菌，致病性大肠杆菌，绿脓杆菌裂解性强的噬菌体毒株，用噬菌体常规培养法获取其培养物。
最后得到的蛭弧菌培养物，蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml；噬菌体培养物，噬菌体的含量为106-13pfu/ml。
4、不同种属细菌培养物的制备：24株不同种属细菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到不同种属细菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为103-7pfu/ml，噬菌体的含量为106-13pfu/ml混合培养物对24株含量为20-70亿cfu/ml不同菌属中的菌株培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以10-35亿个不同种属细菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48、72小时各观察记录结果1次。同时设以大肠杆菌C600为宿主，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为对照组。
5、结果见附表1。
表1.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对不同种属细菌的裂解效果
菌株 混合培养物
霍乱弧菌古典型569B +
霍乱弧菌El Tor型18001 +
霍乱弧菌El Tor型18003 +
霍乱弧菌El Tor型E 97 +
不凝集弧菌17007 +
副溶血弧菌20004 +
福氏志贺氏菌51573 +
福氏志贺氏菌Fl71-1 +
宋氏志贺氏菌51592 +
鲍氏志贺氏菌51582 +
伤寒沙门氏菌50097 +
伤寒沙门氏菌O901 +
副伤寒甲沙门氏菌50001 +
副伤寒乙沙门氏菌50005 +
肠炎沙门氏菌50041 +
鼠伤寒沙门氏菌50013 +
猪霍乱沙门氏菌50019 +
致病性大肠杆菌44813 +
致病性大肠杆菌44817 +
变形杆菌49207 +
绿脓杆菌10102 +
金黄色葡萄球菌26003 +
粪链球菌32221 -
枯草杆菌67501 -
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对22株不同种属的致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对2株常用的微生物生态制剂生产用菌株没有裂解作用。
二、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；弧菌由中国药品生物制品检定所、江苏省疾病控制中心提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对69株弧菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ９８和弧菌噬菌体∮／1b、∮／1c、∮／1d、∮／1j。
3、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml。
4、弧菌培养物的制备：69株弧菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到弧菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为106pfu/ml混合培养物对69株弧菌含量为20-50亿cfu培养物的裂解（包括霍乱弧菌39株,不凝集弧菌10株,副溶血弧菌20株）。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20-50亿cfu弧菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养,48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见附表2。
表2.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对弧菌的裂解效果
组 别 霍乱弧菌 不凝集弧菌 副溶血弧菌 大肠杆菌C600
混合培养物 32（82.05%） 8（80.00%） 18(90.00%) 1（100%）
6、试验结论:
1)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对39株霍乱弧菌中32株有裂解作用，裂解率为82.05%；
2)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对10株不凝集弧菌中8株有裂解作用，裂解率为80.00%；
3)、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对20株副溶血弧菌中18株有裂解作用，裂解率为90.00%。
三、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物致病菌裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供； 水生动物致病菌由中国水产科学院无锡淡水渔业研究中心和上海水产大学提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对11株水生动物致病菌敏感的蛭弧菌Bd59、Bd81、Bd98、Bd296、Bd329和嗜水气单胞菌∮PB31、耶尔森氏菌∮YB1、副溶血性弧菌∮VP3a01、溶藻弧菌∮VB131、荧光假单胞菌∮PS039等噬菌体。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、水生动物致病菌培养物的制备：11株水生动物致病菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到水生动物致病菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为108pfu/ml混合培养物对11株水生动物致病菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu水生动物致病菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600为对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力。
5、结果见表3。
表3.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
嗜水气单胞菌AH1-16 +
耶尔森氏菌08-3 +
链球菌A003 +
假单胞菌PB301 +
副溶血性弧菌53 +
溶藻弧菌07311 +
伤口弧菌S06802 +
鳗弧菌V04389 +
点状气单胞菌0633 +
柱状屈挠杆菌P028 +
荧光假单胞菌YPb0711-6 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对11株水生动物致病性细菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
四、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果测定
1、菌株来源：蛭弧菌、噬菌体由中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供；嗜水气单胞菌由江苏省微生物研究所提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对9株嗜水气单胞菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ８1、Ｂｄ2９6和嗜水气单胞菌噬菌体∮PB31。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、嗜水气单胞菌培养物的制备：9株嗜水气单胞菌分别用营养琼脂平板划线分离，37℃培养18小时，选择典型菌落转种到营养肉汤中37℃培养4-6小时，即得到嗜水气单胞菌培养物。
实验设计：以蛭弧菌含量为106pfu/ml，噬菌体含量为109pfu/ml混合培养物对9株嗜水气单胞菌含量为106-12cfu/ml培养物的裂解。
用双层自来水琼脂平板法，每块平板以20亿cfu嗜水气单胞菌为宿主，同时加0.5ml蛭弧菌和噬菌体混合培养物，于37℃培养48小时观察记录结果。同时设大肠杆菌C600对照组，检查蛭弧菌、噬菌体混合培养物形成噬斑的能力为。
5、结果见表4。
表4.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对嗜水气单胞菌的裂解效果
菌株 混合培养物的裂解
AH1-6 +
AH-6 +
AH-3 +
AH-1 +
AH-4 +
AH1-2 +
AH-3 +
AH1-4 +
AH-2 +
C600 +
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对9株水生动物致病性细菌嗜水气单胞菌都有裂解作用，裂解率为100%。据此推测，蛭弧菌、噬菌体混合培养物对鱼、虾、贝类水生动物细菌病的防治具有较大的理论意义和应用价值。
五、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数清除作用观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对河水中常见的致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ81、Ｂｄ98、Ｂｄ329和弧菌噬菌体∮V3、∮M6，志贺氏菌噬菌体∮P22，伤寒噬菌体∮Vi、∮S154，致病性大肠杆菌噬菌体∮T2、∮T7，绿脓杆菌噬菌体∮PE5。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在自然河水中，加入蛭弧菌的含量为104pfu/ml，噬菌体的含量为105pfu/ml混合培养物。同时设不加蛭弧菌、噬菌体混合培养物对照组。以后定时取水样检测水体中细菌总数的变化。持续30天。
5、结果见表5。
表5. 蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中细菌总数的
时间 (天) 试验1组 试验2组 对照组
0 5.28×105 4.22×105 9.80×105
3 4.78×105 2.00×106 7.92×105
6 4.28×105 3.40×105 1.48×105
9 7.10×104 3.30×104 5.58×104
12 2.00×104 2.46×104 1.41×105
15 1.40×104 2.90×103 4.64×104
18 2.44×103 3.76×103 5.88×104
21 2.34×103 1.86×103 1.46×104
24 774 1.02×103 5.16×103
27 226 668 5.26×104
30 450 510 4.60×103
6、试验结论:
试验组与对照组比较，蛭弧菌、噬菌体混合培养物的河水中细菌总数减少的幅度高于对照组39-55倍。
六、蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制作用的观察
1、菌株来源：中国医学细菌保藏管理中心弧菌噬菌体专业实验室提供。
2、蛭弧菌菌株和噬菌体毒株的筛选：用常规方法从获得的蛭弧菌菌株和噬菌体毒株中筛选出对植物致病菌敏感的蛭弧菌Ｂｄ59、Ｂｄ296和噬菌体∮53K、∮S157。
３、蛭弧菌、噬菌体混合培养物的制备：用步骤2筛选出的菌株按实施例一的方法进行制备。
4、实验设计：在江苏省射阳县发阳农场水产（斑点叉尾鮰鱼）养殖基地进行试验。试验选择蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘10个,每个塘的面积为150m×300m,水深约1.2m。试验组每10天泼洒1次蛭弧菌（含量为108/pfu）、噬菌体（含量为1010/pfu）混合培养物300ml/亩/米。连续3次。然后连续90天观察记录蓝藻生长情况；选择相同环境中蓝藻污染较重的斑点叉尾鮰养殖鱼塘5个，不用蛭弧菌、噬菌体混合培养物而用生石灰的对照组。
5、结果见表6。
表6.蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻控制效果的观察
组别 鱼塘数量 蓝藻控制情况
试验组 10 10个塘中有4个完全控制蓝藻的蔓延直至消失；有5个
塘基本控制蓝藻的蔓延；有1个塘没有控制蓝藻的蔓延。
对照组 5 5个塘中都没有能控制蓝藻的蔓延。
6、试验结论:
蛭弧菌、噬菌体混合培养物对河水中蓝藻的蔓延有非常明显的控制效果。
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