将球形红假单胞菌、噬菌蛭弧菌及粘红酵母予以不同搭配，得到4种微生态制剂，加入中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）幼体培育水体中，研究其对中国对虾幼体生长和非特异性免疫的影响。结果表明，使用这4种微生态制剂均极显著（P<0.01）提高幼体变态率，存活率提高16.86％-34.22％，体长增加0.64-1.29mm；M1-P5期的体长平均增长率也高出17％-40％；酚氧化酶和超氧化物歧化酶活力也显著（P<0.05）高于对照组。其中添加噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌试验组的效果最好，建议中国对虾育苗中联合添加这种微生态制剂，使用浓度为2×105个/ml。

关键词 球形红假单胞菌；噬菌蛭弧菌；粘红酵母；生长；非特异性免疫
近年来对虾的养殖疾病发生频繁、危害严重，截至1992年，查明在我国发生的虾病已有40多种[1]。对虾病原体主要包括病毒、细菌、真菌、原虫、藻类等[2，3]，虽然某些疾病可以用抗生素控制，但是大量使用抗生素能使病菌产生抗药性，抑制对虾自身免疫力，而且还会通过食物链对人类健康构成威胁。因此，“以防为主”成为养殖的首选。
球形红假单胞菌菌体含有丰富的蛋白质、多种维生素和生长因子，能在无氧黑暗条件下对水体中的有害物质进行转化，是作为净水剂和饲料添加剂的理想菌体；噬菌蛭弧菌有独特的“寄生”和“噬菌”生物特性[4]，其应用研究侧重于对环境水体的净化和作为水体污染状况评价的指示菌两方面；粘红酵母(Rhodotorula glutinis)在水体及动物体内外数量始终次于深红酵母，大概占红酵母属的30％左右[5]，但是后者有转化为致病菌的可能[6]，粘红酵母具有适口性好（细胞大小多在4-6μm间），适于工业化大规模生产，能长期保存，在海水中稳定性、分散性好，利用率高等优点。然而单菌种使用有其劣势，且鲜见使用噬菌蛭弧菌和粘红酵母育苗的报道。为了更好发挥优势菌的作用，寻求更佳的菌种配伍，本文将这3株微生态制剂联合使用，初步研究了对中国对虾幼体生长及酶活力的影响，以期为生产实践作一些参考。

1 材料和方法
1.1 材料
试验用的中国对虾无节幼体(N4，平均体长0.38-0.42mm)购自日照涛雒小海育苗场，基础饲料选用日本株式会社0号（Z1~M3）和1号（P1~P5）规格的配合饲料。
噬菌蛭弧菌（以下简称“Z”）由南京巨豹生物工程有限公司提供，球形红假单胞菌（以下简称“Q”）和粘红酵母（以下简称“JM”）均由中国科学院微生物研究所菌种中心提供。
1.2 试验分组及投喂方案
将中国对虾无节幼体暂养1d后，随机分到装有50L海水的PVC桶里，密度为20万尾/m3。从蚤状幼体开始投喂配合饲料，每天投喂8次。另外，在蚤状幼体中加投单胞藻和轮虫；糠虾期幼体中投单胞藻，后期投卤虫无节幼体；仔虾P1-P5期投卤虫无节幼体。共设4个试验组和1个对照组，每组3个重复。各试验组投喂微生态制剂的方案见表1。在喂养前5d加入菌液，试验组水体内加入总浓度为2×105个/ml的复合菌液，以后每隔5d加一次，换水之后补足菌量。
1.3 试验条件及管理
试验用的新鲜海水经沉淀、砂滤，加入4×10-6EDTA-2Na和2×10-6土霉素，充气并预热。在整个试验过程中育苗水体充气，充气量大小随幼体大小进行调整。试验期间水温根据变态发育的需要从19℃逐渐升温到25℃。自糠是幼体Ⅲ期开始换水，每次换水1/2。
1.4 中国对虾幼体变态指数、存活率和体长的计量
1.4.1 变态指数
定期在桶里随机取水样，镜检幼体发育阶段并计算变态指数(development index，DI)。变态指数根据Malecha的描述进行鉴定：DI＝（sumA）/N。
式中：Ａ为每个时期的数值,设Z1=1、Z2=2、Z3=3、M1=4、M2=5、M3=6、PL=7(Z1、Z2、Z3期分别为蚤状幼体I、II、III期；M1、M2、M3期为糠虾幼体I、II、III期；PL为仔虾期)；Ｎ为每次取样的总个体数目。重复两次取平均值。
1.4.2 存活率和体长
分别在Z1期、P5期计数幼体存活尾数，计算Z1-P5期的存活率。
分别在M1期、P5期从每组里随机取（15×2）尾，测量其体长，并计算M1-P5期幼体体长平均增长率。
体长平均增长率（％）＝（P5期平均体长－M1期平均体长）/M1期平均体长。
1.5 免疫指标的测定
酚氧化酶（Phenoloxidase，PO）：以L-DOPA为底物，参照Ashida[7]的方法进行。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)：按邓碧玉等[8]改进的连苯三酚自氧化法进行。
1.6 数理统计方法
用SPSS11.0统计软件进行方差分析，当差异显著（P<0.05）时，用Tukeys检验法进行均值间多重比较。
1.7 中国对虾免疫保护率的测定
P1期幼体经过7d投喂后，每个组随机取100尾仔虾，平均分成两组。一组加入鳗弧菌（Vibrio anguillarum），使总浓度达到5×107个/ml；另一组不加鳗弧菌作为对照组，两组均正常投饵，攻毒5d后试验结束。考虑到仔虾有一定自然死亡率，因此采用相对存活率(Relative Percent Survival,RPS)计算式：
RPS（%）＝（1－免疫组死亡率/对照组死亡率）。

2 结果
2.1 生长指标
2.1.1 变态指数
幼体的变态指数的显著性分析见表2。从表2中可以看出，4个试验组在Z3-M1和M3-P1时变态指数一直极显著（P<0.01）高于对照组；而Z+Q组的变态指数一直极显著（P<0.01）高于Z+JM组和Z+Q+JM组；Z+Q组与Q+JM组差异不显著。
2.1.2存活率和体长
4种微生态制剂对中国对虾幼体存活率和体长的影响见表3。结果表明，Z+Q组的存活率比对照组高出34.22％，P5期的平均体长比对照组长1.49mm，M1-P5期的体长平均增长率比对照组高出40％；而试验组中最差的Z+JM组的存活率也比对照高出16.86％，P5期的平均体长比对照组长0.64mm，M1-P5期的体长平均增长率也高出17％。

2.2免疫指标
2.2.1酚氧化酶（见图1）
从图1中可以看出，在水体中加入微生态制剂后，随着时间的延长，各试验组酚氧化酶活力较对照组有不同程度的提高。Z+Q组的酚氧化酶活力一直极显著（P<0.01）高于其余各组。第24d对照组与z+jm组和z+q+jm组差异不显著（p>0.05），第8d对照组与Z+JM组差异不显著，第16d试验组酚氧化酶活力均极显著（P<0.01）高于对照组。
2.2.2超氧化物歧化酶（见图2）
从图2中可以看出，加入微生态制剂后各试验组超氧化物歧化酶活力较对照组均有不同程度的提高。在第8d时试验组中除了Z+JM组外，其它组均极显著（P<0.01）高于对照组；第16d时，各试验组都极显著（P<0.01）高于对照组，并且Z+Q组和Q+JM组也极显著（P<0.01）高于Z+JM组和Z＋Q+JM组；到了第24d，各试验组都极显著（P<0.01）高于对照组，Z+Q组也极显著（P<0.01）高于其它试验组，而z+jm组和z+q+jm组间差异不显著（p>0.05）。从图中还可以发现SOD的活力在第16d时达到了顶峰，在第24d时总体开始略有下降，而以对照组下降速度最快。2.3 免疫保护率的测定结果（见表4）
从表4中可以看出，攻毒结束时各试验组的成活率均高于对照组。Z+Q组的成活率最高，表明噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌组的免疫保护能力最好，其次是Q+JM的试验组，最差的是Z+JM组。

3 讨论
试验结果表明，使用不同配伍的4种微生态制剂后，试验组的中国对虾在生长、酶活力等方面与对照组相比均有明显提高，尤其是Z+Q组。
3.1在促进生长方面
本试验将4种微生态制剂混合添加到中国对虾幼体水中，与对照组相比均能明显提高变态速度，从而起到加速蜕皮促进生长的作用。这可能是因为微生态制剂有效抑制对虾水体中其它杂藻、杂菌的生长和繁殖，改善了养殖水体的生态系统。田维熙等[9]和马寅斗等[10]分别用光合细菌、海洋酵母培育中国对虾幼体，成活率比对照组分别高出20％和25.7%。而本试验中球形红假单胞菌和噬菌蛭弧菌联合使用则比对照组高出34.22％，这体现了菌种配伍的优势。在养殖中还发现试验组的虾苗个体大、均匀、健壮，而对照组幼体个体大小不一，存在残食现象。造成试验组与对照组如此差距大的原因可能是对照组到后期幼体出现挂脏现象，导致大量死亡，生长严重滞后。
3.2在提高酶活力方面
3.2.1 酚氧化酶
对虾的免疫反应属于非特异性免疫。PO系统在对虾的防御系统中起着重要的异物识别和防御功能，酚氧化酶催化生成的黑色素及黑化反应的中间产物都具有细胞毒性或抗微生物功能，所以酚氧化酶激活系统对于维持甲壳动物体液的无菌性十分重要[11]。在本次试验中，Z+Q组的酚氧化酶活力一直极显著高于其余各组，并且酶活力增加的持续时间长，这样可以增加菌种投喂的间隔时间，节约养殖成本；而Z＋JM组和Z+Q＋JM组到了第24d时已经与对照组差异不显著，后两者与国内的报道[12，13]除了时间上的变化有所差异外，表现出的趋势都是在试验初期酶活力增加速度快，到后期增加缓慢，且与对照组相比差异不显著。
3.2.2 超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶能够催化超氧阴离子的歧化作用，产生过氧化氢和氧，是一种重要的抗氧化酶[14]，与生物的免疫水平密切相关[15]，其活性变化可以作为反映对虾的机能健康状况及衡量对虾免疫状态的指标。本试验加入微生态制剂后，对虾血清的超氧化物歧化酶活力有不同程度的提高，到第16d时达到顶峰，在第24d时全体开始略有下降，而以对照组下降速度最快。表明微生态制剂能够促进机体的抗氧化能力，SOD先升后降的规律与孟凡伦等[16]的报道一致。
在此次试验中，在超氧化物歧化酶活力下降的时候，酚氧化酶却一直在增加。关于酚氧化酶活力一直处于上升状态的现象，可能是由于中国对虾幼体的免疫系统处于健全阶段，而此次试验所测的时间可能正好处于酚氧化酶活力迅速增加阶段，从而使两个试验组到第24d时与对照组差异不显著。莫照兰等[13]发现，气味黄杆菌的胞外糖蛋白对克氏原螯虾成虾的SOD没有影响，而能增强PO活力。幼体这种现象的具体原因有待进一步研究。
3.3 在菌种配伍方面
这4种不同配伍的微生态制剂对中国对虾的作用效果不尽相同，添加噬菌蛭弧菌和粘红酵母的试验组在生长、酶活力及免疫保护率等指标均不及其余试验组，表明二者之间有拮抗作用，如这两种菌体发生了沉淀作用。Z+Q+JM组效果不及Z+Q组的原因也许是因为噬菌蛭弧菌和粘红酵母之间有拮抗作用，菌体只发挥了部分作用。而Q＋JM组的各项指标均高于Z+JM组和Z+Q+JM组，只是稍逊于Z+Q组。
噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌联合使用在各方面都表现出协同作用，显示出其联合使用的优势。此组中球形红假单胞菌菌体含有60％以上的蛋白质，富含多种维生素，特别是VB12、叶酸和生物素，是酵母中含量的几千倍。此外，还有抗病毒的生长因子辅酶Q，含量是酵母的13倍，是幼体适口的饵料。噬菌蛭弧菌则对病原菌有很强地裂解作用，二者联合能有效地吸收氨氮、硫化物等有害物质，这在营养、水质和防治病害上都有力保障了此组在各项指标上处于优势。陈家长等[17]将噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌结合使用于暗纹东方鲀的养殖后改善了水环境，并提高其成活率和生长速度，本试验中此组的结论与之相一致，同时也表明这两株菌的搭配使用是安全有效的。建议联合使用噬菌蛭弧菌和球形红假单胞菌，从促进生长、提高免疫力和提高经济效益三方面考虑，混合浓度定为2×105个/ml。

参考文献
1 吴友吕,吕美玲,郑国兴.中国对虾弧菌红腿病的电镜研究[A].中国甲壳动物学会主编.甲壳动物学论文集[C].青岛:青岛海洋大学出版社,1992.17l~176
2 Hasson K W,Lighte D V,Poulos B T,et al.Taura syndrome in Penaeus vannamei demonstration of a viral etiology[J].Dis. Aquat. org.,1995(23):115~126
3 Flegel T W.Special topic review,major viral diseases of the black tiger praw (Penaeus monodon) in Thailand[J].World J. of Microbiol. Biotechnol., 1997(13):433~442
4 Shilo M.Current prospectives in microbial ecology[J].Washington D C American Society for Microbiology,1984,334~339
5 周与良,黄铁石,但汉斌,等.中国海红酵母属(Rhodotorula Harrison)的种类[J].南开大学学报(自然科学版),1999,32(4):115~116
6 刘钢,王玉香,周与良.鱼体上红酵母(Rhodotorula)菌的分布[J].南开大学学报(自然科学版),1999,32(1):124~125
7 Ashida M.Purification and characterization of pre-prophenoloxidase from hemolymph of the silkworm,Bombyx Mori[J].Arch.Biochem. Biophys.,1971,144(2):749~762
8 邓碧玉,袁勤生,李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法[J].生物化学与生物物理进展,1991,18(2):163~163
9 田维熙,陈俊芹,黄莉莉,等.光合细菌在对虾养殖中应用效果的研究[J].饲料研究,1995（8）:4~6
10 马寅斗,宋学章.海洋酵母的筛选及应用试验[J].工业微生物,1997,27(2):34~36
11 孟凡伦,张玉臻.甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统研究评价[J].海洋与湖沼,1999,30(1):110~115
12 王雷,李光友,毛远兴.口服免疫药物后中国对虾某些血淋巴因子的测定及方法研究[J].海洋与湖沼,1995,26(1):34~41
13 莫照兰,李会荣,俞勇,等.细菌糖蛋白对螯虾免疫因子的影响[J].中国水产科学,2000,7(3):28~32
14 Tonya L.Nichols,Chris A.Whitehouse,Faye E.Austin.Transcriptional analysis of a superoxide dismutase gene of Borrelia burgdorferi[J].FEMS Microbiology Letters,2000（183）:37~42
15 丁美丽,林林,李光友,等.有机污染对中国对虾体内外环境影响的研究[J].海洋与湖沼,1997,28(1):7~12
16 孟凡伦,马桂荣,孔健.乳链球菌SB900肽聚糖对中国对虾免疫功能的影响[J].山东大学学报(自然科学版),1999,34(1):88~93
17 陈家长,胡庚东,吴伟,等.有益微生物在暗纹东方对虾养殖中应用的研究[J].浙江海洋学院学报(自然科学版),2004,23(3):195~198